Clonally variant non-coding RNA family and its role in Plasmodium falciparum antigenic variation
Famille clonalement variable des ARN non codants et son rôle dans la variation antigénique de Plasmodium falciparum
Résumé
Antigenic variation is an immune evasion mechanism used by the malaria parasite Plasmodium falciparum to establish prolonged infection. It prevents parasite clearance by switching the display of variant surface antigens encoded by the 60-member var gene family. Blood stage parasites express var genes in a mutually exclusive manner, with a single var active at a given time, ensuring that the immune system remains naive to a parasite sub-population. Despite multiple factors known to be involved in default var gene silencing, such as histone modifications and nuclear architecture, a specific activation factor has not been identified yet. In this thesis work, a polymerase III-transcribed family of GC-rich ncRNA was explored as a candidate regulatory factor of var gene activation. The GC-rich ncRNA family consists of 15 homologous members positioned adjacent to chromosome-central var genes. RNA FISH analysis revealed that the GC-rich ncRNA is targeted to the var expression site in trans. Overexpression of one GC-rich ncRNA member overrules singular var expression and induces transcription of a specific subset of var genes. We developed a dead Cas9 system aiming to target transcription of all GC-rich members. Strikingly, transcriptional blocking of all GC-rich members by CRISPR interference results in down-regulation of var transcription to background levels. Our data support a role of this ncRNA in the activation process of var genes. Moreover, we show that the GC-rich ncRNA gene family is clonally variant, indicating that this may determine switch rate and switch order of the var gene family. We developed a robust ChIRP (chromatin isolation by RNA purification) protocol that allowed us to identify potential chromatin binding regions and interacting partners of this ncRNA family. The validation of several promising candidate proteins obtained my mass spectrometry is ongoing. Furthermore, we investigated whether the gene loci of these ncRNAs display long-range interactions using a chromosome conformation capture technique. We obtained evidence that the gene loci of these ncRNAs display long-range interactions between them and can thus play a role in nuclear spatial foci organization. This study provides the first functional link between Pol III and Pol II transcription in the process of mutually exclusive expression of virulence genes. Moreover, exploring this ncRNA is a key step in unveiling the process of immune evasion and pathogenesis of P. falciparum.
La variation antigénique est un mécanisme d'évasion immunitaire utilisé par le parasite du paludisme Plasmodium falciparum pour établir une infection prolongée. Il empêche la clairance parasitaire en modifiant l’expression des antigènes variables de surface, codés par la famille de gènes appelés « var », comprenant 60 membres. Au stade sanguin, les parasites expriment les gènes var d'une manière mutuellement exclusive, avec un seul gène var actif à un moment donné, permettant ainsi au parasite d’échapper au système immunitaire qui reste naïf envers une sous-population de parasites. Malgré les multiples facteurs connus pour être impliqués dans l’inactivation des gènes var par défaut, tels que les modifications des histones et l'architecture nucléaire, un facteur d'activation spécifique n'a pas encore été identifié. Dans ce travail de thèse, une famille d'ARNnc riche en GC, transcrite par l’ARN polymérase III, a été explorée comme facteur régulateur candidat à l'activation des gènes var. La famille des ARNnc riches en GC se compose de 15 membres homologues, positionnés de façon adjacente aux gènes var situés au centre du chromosome. L'analyse d’expériences de FISH de l'ARN a révélé que l'ARNnc riche en GC cible le site d'expression du gène var en trans. De plus, la surexpression d'un membre des ARNnc riches en GC surpasse l'expression mutuellement exclusive des gènes var et induit la transcription d'un sous-ensemble spécifique de gènes var. Nous avons développé un système de dead Cas9 ciblant la transcription de tous les membres riches en GC. Il est frappant de constater que le blocage transcriptionnel de tous les membres riches en GC par interférence CRISPR entraîne une régulation à la baisse de la transcription des gènes var à un niveau basal. Nos données confirment le rôle de cet ARNnc dans le processus d'activation des gènes var. De plus, nous montrons que la famille de gènes de l'ARNnc riche en GC est une variante clonale, ce qui indique que cela peut déterminer les taux de commutation et l'ordre de commutation de la famille de gènes var. Nous avons développé un protocole ChIRP (chromatin isolation by RNA purification) robuste qui nous a permis d'identifier des régions potentielles de liaison à la chromatine et des partenaires interagissant avec cette famille d'ARNnc. La validation de plusieurs protéines candidates prometteuses obtenues par spectrométrie de masse est en cours. De plus, nous avons cherché à savoir si les loci géniques de ces ARNnc présentent des interactions à longue distance, à l'aide d'une technique de capture de conformation chromosomique. Nous avons obtenu la preuve que les loci géniques de ces ARNnc présentent des interactions à longue distance entre eux et peuvent donc jouer un rôle dans l'organisation spatiale des foci nucléaires. Cette étude fournit le premier lien fonctionnel entre la transcription de l’ARN Pol III et Pol II dans le processus d'expression mutuellement exclusive des gènes de virulence. De plus, l'exploration de cet ARNnc est une étape clé dans le dévoilement du processus d'évasion immunitaire et de la pathogenèse de P. falciparum.
| Origine | Version validée par le jury (STAR) |
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